Beschreibung
In dieser Arbeit wurden ausgewählte mikrobielle Expressionssysteme genutzt, um eine biotechnologische in vivo und in vitro Xanthophyllsynthese zu etablieren. Hierbei wurde zum einen die Astaxanthin Synthase im Zusammenhang mit ihrer kompatiblen Reduktase und zum anderen verschiedene ß-Carotin-Hydroxylasen und -Ketolasen auf ihre Eignung und Nutzbarkeit untersucht. Durch heterologe Expression der Gene, die für die Astaxanthin Synthase sowie ihre Reduktase kodieren, wurde, trotz einer großen Zahl genetischer Modifikationen und vielfältiger Versuche zur Optimierung des verwendeten Expressionssystems sowie der zugehörigen Bedingungen, weder eine in vitro noch in vivo Xanthophyllsynthese in den Prokaryoten E. coli und R. sphaeroides erreicht. Die Ergebnisse dieser Versuchsreihen führten zu der Schlussfolgerung, dass die Expression der Astaxanthin Synthase und ihrer Reduktase spezifische Voraussetzungen im Rahmen der posttranslationalen Prozessierung sowie der Insertion in die Zellmembran bedarf, die in den untersuchten Prokaryoten nicht gegeben sind. So wurde hingegen eine (His)6-Tag gekoppelte Astaxanthin Synthase erfolgreich in der P. rhodozyma-Mutante PR-1-104 homolog exprimiert und damit eine Komplementierung der in vivo Astaxanthinsynthese erzielt. Hierbei konnte in Abhängigkeit der Lokalisation des Tags eine um 14 % höhere intrazelluläre Astaxanthinkonzentration erreicht werden als mit dem Wildtyp CBS 6938. Allerdings war aufgrund des hohen Grades der Proteindenaturierung in Folge der Membranproteinextraktion aus der rigiden Phaffia- Zellwand eine in vitro Astaxanthinsynthese nicht etablierbar und so eine Enzymcharakterisierung nicht möglich. Die heterologe Expression des Astaxanthin Synthase- sowie Reduktase-Gens war in einer carotinogenen Bäckerhefe ebenso erfolgreich. Hier konnte eine in vivo Astaxanthinsynthese etabliert werden, die mit 5,4 µg g -1 TM die publizierten Daten um 80 % übersteigt. Allerdings zeigte sich bei Expression verschiedener Varianten des Astaxanthin Synthase- sowie Reduktase- Gens in unterschiedlichen carotinogenen Stämmen, dass die Wahl des Expressionsvektors von immenser Bedeutung für deren funktionelle Expression in S. cerevisiae ist. Für die in vivo Xanthophyllsynthese mittels heterologer Expression von verschiedenen ß-Carotin-Hydroxylasen und -Ketolasen in carotinogenen Bäckerhefen wurde zunächst die Konstruktion von S. cerevisiae-Stämmen mit gesteigerter ß-Carotinbereitstellung durch Überexpression der trunkierten HMGCoA-Reduktase bzw. des ABC-Transporters PDR10 angestrebt. Hierbei wurde ausschließlich durch Einbringen des modifizierten HMG1-Gens die ß- Carotinsynthese im Vergleich zum Ausgangsstamm leicht gesteigert. Nach heterologer Expression von crtZ aus P. ananatis wurden mit maximalen in vivo Zeaxanthinmengen von 309 µg g -1 TM die bisher höchsten Werte für eine heterologe Synthese mit S. cerevisiae erreicht. Höchste in vivo Astaxanthinkonzentrationen von 10 µg g -1 TM wurden bei Co-Expression von bkt aus H. pluvialis mit crtZ aus Paracoccus sp. PC-1 sowie mit crtZ aus Brevundimonas sp. SD212 erzielt. In vitro wurde eine maximale Astaxanthinakkumulation von 0,009 µg mL -1 mittels BKT aus H. pluvialis in Kombination mit CRTZ aus Brevundimonas sp. SD212 erreicht. Des Weiteren gaben die durchgeführten in vitro Studien Aufschluss über die Substratpräferenz und Aktivität der ß-Carotin-Hydroxylasen sowie -Ketolasen, so dass sich hier katalytische Engpässe als Ziele für eine zukünftige genetische Optimierung der sukzessiven Oxygenierung von ß-Carotin zu Astaxanthin ableiten ließen.
